關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）是生物學(xué)特征，會(huì)影響安全性和有效性，必須得到密切監(jiān)測(cè)，因此需要使用各種分析技術(shù)對(duì)分子進(jìn)行大量測(cè)試。

定義太空洞？當(dāng)我們?cè)谡務(wù)撽P(guān)鍵質(zhì)量屬性時(shí)我們?cè)谡務(wù)撌裁矗拷裉靵?lái)談?wù)劦味葴y(cè)定和電荷異構(gòu)體分析。CQA 檢測(cè)中，除了聚集體分析至關(guān)重要之外，滴度測(cè)定和電荷異構(gòu)體分析也分別起到不同的作用。

滴度測(cè)定

滴度測(cè)定雖然不直接測(cè)量 CQA，但常作為生物治療蛋白生產(chǎn)的第一步質(zhì)量檢查。異常滴度可反映細(xì)胞株或培養(yǎng)基存在的問(wèn)題，這些問(wèn)題可能會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)性或產(chǎn)品出錯(cuò)而不僅是降低產(chǎn)率。使用 UV 檢測(cè)的 Protein A 親和捕獲色譜是生物制藥中用于單克隆抗體 ( mAb )滴度測(cè)定的一種普遍方法。許多實(shí)驗(yàn)室選擇基因修飾的重組 Protein A 平臺(tái)，因?yàn)橹亟M蛋白質(zhì)通常更穩(wěn)定，有更長(zhǎng)的色譜柱壽命。天然（純化）Protein A 的吸引力在于對(duì)某些 IgG 具有更緊密的結(jié)合親和性。Protein A 產(chǎn)品可用作預(yù)裝填柱、整體床柱和供用戶填裝使用的松散介質(zhì)。整體床色譜柱具有更大孔徑的篩板，因此不易堵塞，對(duì)復(fù)雜樣品基質(zhì)更加耐用。

異常滴度可能需要分析用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基，以排除低產(chǎn)量的原因。氨基酸是培養(yǎng)基的主要成分，可以通過(guò)多種技術(shù)進(jìn)行分析，最常見(jiàn)的是利用 LC/UV 分析衍生化氨基酸。衍生化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以廣泛應(yīng)用，并可通過(guò)反應(yīng)化學(xué)引入一定程度的特異性，但是人們對(duì)分析未衍生化氨基酸以最大限度縮短樣品前處理時(shí)間也越來(lái)越感興趣。未衍生化氨基酸不具有 UV 吸收，因此需要用到其他檢測(cè)器，如蒸發(fā)光散射( ELSD ) 或質(zhì)譜 ( MS ) 檢測(cè)器。

然而，ELSD 的靈敏度不夠高，僅能達(dá)到低納摩爾水平，而衍生化氨基酸的 UV 檢測(cè)可以達(dá)到低皮摩爾水平。MS 分析檢測(cè)也能得到更高的靈敏度，在數(shù)量級(jí)上實(shí)現(xiàn)提升。雖然MS 儀器的成本一直是此方法廣泛使用的阻礙，但其引發(fā)的越來(lái)越廣泛的關(guān)注已經(jīng)使供應(yīng)商開(kāi)始在市場(chǎng)中引入經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且切合實(shí)際需求的質(zhì)譜儀。

隨著 MS 更廣泛的使用，快速有效地分離分子量較小的極性分子成為一個(gè)需要克服的挑戰(zhàn)。使用反相色譜柱分析離子對(duì)可得到非常穩(wěn)定的結(jié)果，但需要專用儀器。過(guò)去， 親水相互作用色譜 ( HILIC ) 一直在努力滿足市場(chǎng)對(duì)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的要求，而最近推出的色譜柱在這方面已經(jīng)有了重大改進(jìn)。

電荷異構(gòu)體分析

使用 UV 檢測(cè)的離子交換色譜 ( IEX ) 常用于分離由 PTM（如賴氨酸截短、脫酰胺或唾液酸化）產(chǎn)生的電荷異構(gòu)體。此項(xiàng)分析通常也在完整蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行，因?yàn)檫@種變化可以被檢測(cè)到，但無(wú)法進(jìn)行特定的鑒定和定位，IEX 通常使用鹽梯度來(lái)進(jìn)行，這些高濃度的非揮發(fā)性鹽不適用于 MS。因此，一個(gè)新的關(guān)注點(diǎn)是使用 pH 梯度而非鹽梯度，這樣便可以使用低濃度且可以有效揮發(fā)的緩沖鹽流動(dòng)相，以便和 MS 聯(lián)用。為了保留樣品，IEX 要求樣品具有與固定相相反的極性電荷。鹽梯度 IEX 使用高濃度鹽來(lái)破壞這些離子的相互作用并洗脫分析物。pH 梯度必須跨越分析物的等電點(diǎn) ( pI )，以便蛋白質(zhì)在電中性時(shí)被洗脫。盡管線性 pH 梯度難以重現(xiàn)，但 pH 梯度可以將分析物

聚集到較窄的譜帶中，從而獲得比鹽梯度更高的分離度。由于必須非常精確地控制并適當(dāng)?shù)剡x擇流動(dòng)相 pH、離子強(qiáng)度和梯度組分，可靠的 IEX 方法開(kāi)發(fā)具有挑戰(zhàn)性。通常需要進(jìn)行大量的方法開(kāi)發(fā)，但可以利用軟件來(lái)篩選僅由少量?jī)?chǔ)備液制備的復(fù)合緩沖系統(tǒng)的梯度，從而簡(jiǎn)化方法開(kāi)發(fā)。

毛細(xì)管等電聚焦 ( cIEF ) 也常用于電荷異構(gòu)體分析。類似于 pH 梯度 IEX，cIEF 也是基于 pI 進(jìn)行蛋白質(zhì)異構(gòu)體分離，是一項(xiàng)驗(yàn)證 IEX 結(jié)果的常用技術(shù)。